Ống kính RF 100mm F2.8L Macro IS USM là ống kính macro đầu tiên dành cho hệ máy mirrorless full-frame của Canon. Đây là một ống kính tele tầm trung với khoảng cách lấy nét tối thiểu 26cm và độ phóng đại tối đa 1.4x. Hệ thống chống rung quang học (IS) giúp giảm rung đến 5 stop khi sử dụng độc lập và lên đến 8 stop khi kết hợp với thân máy có chống rung, như EOS R5. Khi chụp cận cảnh, chế độ chống rung lai (Hybrid IS) được kích hoạt, giúp bù rung theo cả góc xoay và dịch chuyển ngang/dọc của máy ảnh.
Về quang học, RF 100mm F2.8L có 17 thấu kính chia thành 13 nhóm. Lớp phủ Super Spectra giúp giảm hiện tượng lóa và bóng ma. Hệ thống lấy nét sử dụng hai mô-tơ Nano USM để di chuyển nhóm thấu kính lấy nét. Ngoài ra, ống kính còn có vòng điều chỉnh quang sai cầu (SA Control), cho phép người dùng tùy chỉnh hiệu ứng bokeh và độ mềm mại của hình ảnh.
Như các ống kính dòng L khác, RF 100mm F2.8L được thiết kế chống bụi và chống ẩm. Lớp phủ fluorine trên thấu kính trước giúp hạn chế bám dầu và nước, dễ dàng vệ sinh hơn.